Introdução à espectroscopia

Definição e conceitos importantes

A espectrometria é um conjunto de recursos que nos permite identificar a estrutura das partículas que constituem as substâncias. Atualmente existem tecnologias tão avançadas que se torna possível descrever com precisão a estrutura exata de uma molécula. Os equipamentos modernos permitem detectar os tipos de elementos presentes no composto, a quantidade de cada um deles, a posição tridimensional de cada átomo e muito mais. Esses aparelhos funcionam basicamente a partir de feixes de onda eletromagnética incidentes sobre uma amostra do composto, que então, absorve energia em determinados comprimentos de onda. Os valores da energia e dos comprimentos de onda absorvidos são detectados no aparelho e transformados em um gráfico no computador. É então pela análise desse gráfico que se determina a estrutura da molécula.

Alguns termos básicos devem ser conhecidos:

Comprimento de onda = Distância medida ao longo a linha de propagação entre dois pontos equivalentes que estão em fases adjacentes da onda.
Freqüência = Número de ciclos por unidade de tempo.
Transmitância (T) = Razão entre a energia radiante transmitida por uma substância e a energia radiante incidente nessa substância: T = E t/E i
Amplitude da onda (A) = comprimento de um vetor no máximo ou mínimo da onda
Absorbância ou Absorvância (A) = log (1/T)
Absortividade molar = Relação descrita pela absorbância dividida pelo produto da concentração C da substância (amostra) e o comprimento óptico (b) percorrido pela radiação: = A/(C . b )
Absortividade (a) = representa o mesmo que a absortividade molar, mas é usada quando a concentração não está expressa em molar (M).
Velocidade de propagação (v) = taxa de deslocamento de uma frente de onda num determinado meio (é dependente do meio). v = n l
Índice de refração = razão entre a velocidade da luz e a velocidade de propagação da radiação num determinado meio. h = c / v
Número de onda = número de ondas de uma determinada freqüência presentes numa distância de 1 cm.

Algumas relações importantes:

E = h h = constante de Planck = 6,63.10-34 J.s
   
E = (h c) / c = velocidade da luz no vácuo = 3,0.10 10 cm / s
   
E = h c  

A absorção de energia

Radiação

Comprimento de
onda #

Efeito causado nas partículas

Raio Gama

< 120 nm

-----

UV no vácuo

100 - 200 nm

Transição eletrônica

UV próximo

200 - 380 nm

Transição eletrônica

Luz visível

380 - 800 nm

Transição eletrônica

Infravermelho

8 - 300 nm

Vibração e deformação

Microondas

1 cm

Rotação

Radiofrequência

metros

Acoplamentos de spins

# Estes valores não são absolutos; às vezes encontramos valores diferentes dentro de uma mesma referência

"A energia radiante..." (complementando)

energia radiante, também chamada energia eletromagnética, percorre 3 x 108 m/s no vácuo. Para definir uma onda eletromagnética falamos basicamente em três aspectos: velocidade, freqüência e comprimento de onda . Freqüência de uma onda corresponde ao número de cristas ou de vales que passam num dado ponto por um segundo. É medida em Hertz (Hz), que corresponde a ciclos por segundo. O comprimento de onda , medido em metros ou nanômetros (1 nm = 10-9 m), é a distância entre dois pontos comparáveis da onda, em cristas ou vales. A velocidade da onda é dada pelo produto da freqüência pelo comprimento de onda: v = .

A região do visível é dividida em algumas faixas de comprimentos de onda, cada uma caracterizando uma cor:

de máxima absorção (nm)

Cor absorvida

Cor observada

380 – 420

violeta

verde/amarelo

420 – 440

violeta/azul

amarelo

440 – 470

azul

alaranjado

470 – 500

azul/verde

vermelho

500 – 520

verde

roxo

520 – 550

amarelo/verde

violeta

550 – 580

amarelo

violeta/azul

580 – 620

alaranjado

azul

620 – 680

vermelho

azul/verde

680 – 780

roxo

verde

# Estes valores não são absolutos; outras tabelas podem apresentar ligeiras diferenças

A luz branca é a combinação de todos estes comprimentos de onda. Se enxergamos uma solução com a cor verde, por exemplo, é porque as moléculas em solução absorveram todo o componente vermelho (e roxo, dependendo do caso). Isto quer dizer que a luz branca menos o componente vermelho dará a luz verde. Observe na tabela anterior que se uma solução absorve o roxo e o vermelho, a cor observada é a verde (ou verde/azulada), ou seja, observamos apenas a parte que não foi absorvida pelas soluções.

É importante notar que quanto maior for o comprimento de onda, menor será a energia (ver Algumas relações importantes); por exemplo, a solução que enxergamos azul absorveu entre 580 e 620nm; uma solução alaranjada, por sua vez, absorveu entre 440 e 470 nm e podemos dizer que a absorção de energia foi maior no caso da solução alaranjada.

Espectrometria no Ultravioleta

Quando a radiação eletromagnética da região do UV passa através de um composto que tem ligações múltiplas (duplas e triplas), uma parcela da radiação é, usualmente absorvida pelo composto. A quantidade de radiação absorvida depende do comprimento de onda da radiação e da estrutura do composto. A absorção ocorre pela subtração de energia do feixe de radiação provocada pela excitação dos elétrons de orbitais de baixa energia para orbitais de energia mais elevada. A espectrometria no UV, portanto, provoca transições eletrônicas.

 
Desta forma, para que um composto possa ser detectado com radiações na região do UV, é necessário que esse composto possua elétrons capazes de serem excitados, ou seja, elétrons pi ou elétrons livres (não-ligantes). Os elétrons sigma não podem ser excitados, porque a transição de elétrons de uma ligação sigma acarretaria a quebra da ligação e, consequentemente, a perda da estrutura característica do composto.
 

O gráfico de absorção:

A energia absorvida por uma substância é quantizada (como citado acima) e característica dessa substância, ou seja, ocorre em certos valores específicos. Assim, espera-se, num gráfico de comprimento de onda (x) em função da absorbância (y), picos lineares de maior intensidade de absorção. Entretanto, devido a outras absorções simultâneas surgem bandas espectrais no gráfico.

Na ilustração abaixo vemos os picos de maior absorção, que são aqueles pontos nos quais ocorreram as transições eletrônicas. Porém, as energias absorvidas nas rotações, vibrações e deformações das partículas também aparecem no gráfico, e por isso surgem bandas, em linhas contínuas geradas por integração da função. Quanto menor for a diferença entre o estado fundamental e o excitado, menor será a energia necessária para a transição eletrônica e maior será o comprimento de onda. Veja um exemplo de espectro no UV obtido a partir do 2,4-dinitrofenolato de potássio:

A posição da absorção corresponde ao comprimento de onda da radiação necessário para a transição eletrônica e a intensidade da absorção depende da probabilidade de interação entre a radiação e o sistema eletrônico. Depende também da diferença entre o estado fundamental e o estado excitado da partícula. A probabilidade da transição ocorrer é diretamente proporcional ao quadrado do momento de transição (equivale ao momento de dipolo). O momento de transição é proporcional à variação da distribuição de carga durante a excitação.

Cálculos teóricos de absorção
A partir da estrutura molecular da substância é possível prever, com pequena margem de erro, o seu máximo de absorção (max), ou seja, o comprimento de onda máximo absorvido pelo composto. Antes de prosseguir, porém, devemos conhecer alguns conceitos fundamentais:

  • Grupo Cromóforo - Grupo insaturado covalente, responsável pela absorção.
  • Grupo Auxócromo (auxocrômico) - Grupo saturado que, quando ligado ao cromóforo, altera o valor do comprimento de onda e/ou a intensidade da absorção necessárias para a transição eletrônica. Essas alterações podem constituir um:

1- Deslocamento Batocrômico - deslocamento da absorção para um maior;
2- Deslocamento Hipsocrômico - deslocamento da absorção para um menor;
3- Efeito Hipercrômico - aumento da intensidade da absorção;
4- Efeito Hipocrômico - diminuição da intensidade da absorção.

Na estrutura de uma molécula a ser analisada no UV, consideramos diversas partes especiais, às quais se atribuem valores aproximados de max . Para efetuar um cálculo de max , primeiramente identifica-se o cromóforo principal da molécula, isto é, aquela parte da cadeia que possui o maior número de duplas conjugadas e/ou grupamentos funcionais. Tudo aquilo que estiver ligado ao cromóforo principal será tratado como "incremento". Assim, temos tabelas de valores de max para alguns cromóforos mais comuns. Esses valores são chamados "valores base".

Os alquenos e dienos não-conjugados têm, em geral, máximo de absorção abaixo de 200 nm, enquanto as moléculas que possuem ligações múltiplas conjugadas têm máximo de absorção geralmente acima de 200 nm. Isso significa que em compostos de duplas conjugadas a absorção de energia é menos intensa, já que o comprimento de onda é maior (lembre-se que Ee são grandezas inversamente proporcionais).

Medidas espectrofotométricas

O espectro UV/Vis de um composto normalmente é obtido em fase de vapor ou em solução. Alguns solventes, entretanto, devem ser usados com cautela por não ser transparentes à radiação em toda a faixa espectral de 190 a 800nm, aproximadamente.

Por exemplo, não podemos tentar analisar uma amostra que apresente uma banda de absorção a 240 nm se o solvente usado for o clorofórmio, pois este solvente só é transparente após 245 nm, aproximadamente. Por outro lado, água e acetonitrila podem ser usados sempre, pois são totalmente transparentes à radiação na faixa UV/Vis.

A escolha de um solvente para a espectroscopia eletrônica

As exigências a serem satisfeitas pelo solvente de uma determinação espectrofotométrica são as seguintes:

  • solvente deve dissolver facilmente a substância de interesse
  • não deve haver interação significativa soluto – solvente
  • solvente não deve ter absorção significativa no comprimento de onda de interesse do soluto

Para os compostos inorgânicos a água preenche estas usualmente estas exigências, mas no caso da maioria dos compostos orgânicos é necessário um solvente orgânico. Uma complicação imediata aparece com os solventes polares (álcoois, éteres, cetonas), que tendem a mascarar a estrutura fina dos espectros de absorção (estrutura relacionada aos efeitos vibracionais). A fim de preservar os detalhes as medições de absorção dever ser feitas em solventes apolares.

Outro problema é que todos os solventes têm absorção em algum comprimento de onda no ultravioleta, devendo ser tomado cuidado para que o solvente escolhido para uma determinação seja transparente na região de interesse para a análise. Para isso verifica-se, em tabelas, qual o “comprimento de onda de corte” para os vários solventes. Este parâmetro é o comprimento de onda no qual a transmitância se reduz a 25% em relação à água em celas de 10 cm. Qualquer impureza no solvente pode afetar o valor de “corte”, sendo essencial o uso de solventes de alta pureza (solventes Spectrosol).

Alguns valores típicos dos comprimentos de onda de corte de solventes:

Solvente

(nm)

Solvente

(nm)

Solvente

(nm)

Água

190

Etanol

207

CHCl3

247

Hexano

199

Metanol

210

CCl4

257

Heptano

200

Ciclohexano

212

Benzeno

280

Dietil éter

205

CH2Cl2

233

Piridina

306

 

 

 

 

Propanona

337

Lei de Beer

A relação entre a absorbância de uma amostra e sua concentração é dada pela Lei de Beer:

sendo A = absorbância;

= coeficiente de absortividade molar;

b = comprimento do caminho óptico (tamanho da cubeta ou cela), em cm

c = concentração molar

Cada substância apresenta um valor diferente de e em cada comprimento de onda.

Absorções fortes (> 104) são acompanhadas de grande variação no momento de transição, o que não ocorre nas absorções fracas (< 103). As transições de baixa probabilidade são chamadas transições proibidas, e são aquelas que não criam um momento de dipolo considerável entre o estado fundamental e o estado excitado. No entanto, elas podem ocorrer, gerando pequenos ombros no gráfico, ou picos de intensidade muito baixa.
Para se medir a quantidade de energia luminosa absorvida em cada comprimento de onda, na região do UV, usam-se instrumentos denominados espectrofotômetros. Nestes instrumentos, um feixe de luz é dividido em dois: uma das metades do feixe passa através de uma célula transparente que contém a solução do composto que será analisado e a outra metade do feixe passa através de outra célula, contendo apenas o solvente que está sendo utilizado. O instrumento opera de modo a fazer uma comparação entre as intensidades dos dois feixes em cada comprimento de onda da região. O instrumento dá a resposta na forma de um gráfico no computador, relacionando comprimento de onda e absorbância: o espectro de absorção.
Os espectros de absorção no UV mostram bandas de absorção geralmente largas, pois cada nível de energia eletrônica está associado a subníveis de rotação e vibração. Assim, as transições dos elétrons podem ocorrer a partir de um entre vários estados de vibração e de rotação de um nível de energia eletrônica para um entre diversos estados de vibração e de rotação do nível energético mais elevado.

Desvios da lei de Beer

A forma de uma curva de absorção pode muitas vezes variar com as mudanças de concentração da solução e, a menos que se tomem precauções, poderão ser notados desvios aparentes na lei de Beer.

A Lei de Lambert-Beer somente se aplica quanto os centros absorventes não interagem uns com os outros. Isto obviamente só é conseguido em concentrações muito pequenas. Em termos práticos, as concentrações limites até as quais esta lei é obedecida situam-se na faixa de 10-2 M para a maioria dos compostos. Até estas concentrações as moléculas (centros absorventes) interagem predominantemente com o solvente. Em concentrações superiores, iniciam-se interações também entre as moléculas do soluto (cromóforo), fazendo com que o e e o l de certos picos de absorbância sejam alterados (“blue ou red shift” - deslocamento para o azul ou vermelho). Lembrem-se de que um certo espectro com os seus respectivos e é característico daquela substância em um determinado solvente. Em concentrações muito altas, as interações entre as moléculas do soluto se tornam tão elevadas que predominam sobre as interações solvente-soluto, fazendo com que o próprio soluto aja como solvente, produzindo alterações na absorbância.
Outra fonte de erro pode ser o índice de refração, que pode aumentar significativamente em soluções concentradas, desviando parte da luz e diminuindo a intensidade detectada.
O equipamento de detecção também pode representar uma fonte de erro, principalmente em concentrações muito baixas ou muito elevadas, nas quais a intensidade de luz transmitida é muito próxima ou muito distante, respectivamente, da intensidade do feixe que não passa pela amostra, fazendo com que as comparações se tornem muito menos precisas.

Métodos de Calibração

Curvas de calibração

Normalmente um analista químico é capaz de determinar a concentração de espécies variadas em amostras baseando-se na informação fornecida por soluções de concentração conhecida, denominadas soluções – padrão, de maneira que a resposta instrumental encontrada para uma amostra desconhecida possa ser interpretada.
A maneira mais simples de se conseguir a quantificação é preparar uma curva de calibração, ou seja, um gráfico que mostra a resposta de um método analítico como função de uma quantidade conhecida de analito a ser medida. Na maioria das vezes procuramos trabalhar em uma região em que a resposta instrumental seja função linear da concentração, de modo que procuramos encontrar a melhor reta que possa descrever o comportamento dos valores medidos para as soluções-padrão.
O método mais utilizado para encontrar esta melhor reta é o chamado método dos mínimos quadrados. Para o procedimento descrito a seguir é necessário que os erros nos valores de Y sejam consideravelmente maiores que os de X, o que é uma condição normalmente verdadeira para curvas de calibração nas quais a resposta instrumental medida (Y) é menos segura que a quantidade de analito no experimento (X). Uma outra condição é que os valores dos desvios-padrão em todos os valores sejam similares.

Graficamente temos

Para encontrar facilmente o valor de a (a inclinação da reta) e de b (o ponto onde a reta cruza o eixo Y) podemos usar a álgebra matricial.
O determinante de uma matriz de duas linhas por duas colunas (2x2) é calculado como mostrado a seguir:

Para o método dos mínimos quadrados fazemos:

x = valores de x;

n = número de pontos considerados;

= somatório de valores

Temos, então:

x = valores de x;
y = valores de y;
n = número de pontos considerados;
xy = valor do produto de cada x pelo y correspondente;
x2 = valor do quadrado de cada x.
= somatório de valores

Um exemplo simples: Considerando os seguintes valores de X e Y, encontre a melhor reta que explique os dados.

x

0

1

2

3

4

5

y

4

7

10

13

16

19

x = 0+1+2+3+4+5 = 15
y = 4+7+10+13+16+19 = 69
xy = 0+7+20+39+64+95 = 225
x 2 = 0+1+4+9+16+25 = 55
n = 6

Então a equação da reta é y = 3x + 4

Conforme já foi citado, as soluções que contêm concentrações conhecidas de um (ou diversos) analito(s) são chamadas de soluções-padrão. Por outro lado, as soluções que contêm todos os reagentes e solventes usados na análise mas não contêm a espécie (ou as espécies) de interesse são chamdas de soluções em branco (ou simplesmente brancos) e servem para medir a resposta do procedimento analítico para impurezas ou espécies interferentes nos reagentes.

Para construir uma curva de calibração um procedimento adequado é o seguinte:

  1. preparar soluções de concentração conhecida do analito e soluções em branco e fazer a medida da resposta instrumental de cada uma;
  2. subtrair de cada resposta das soluções-padrão a resposta da solução em branco;
  3. calcular a inclinação e o coeficiente linear dos dados, considerando que é possível obter uma boa linha reta para explicar as respostas (ou seja, considerando que a resposta do detector ou instrumento analítico seja linear com a concentração das amostras);

Para finalizar, usar os valores registrados para novas amostras (novos valores de Y) para calcular os valores de X.

Por exemplo, usando um eletrodo seletivo para fluoreto podemos ter um gráfico de [F-] versus E (mV), de modo que nossa reta seria E = a [F-] + b.

Se sabemos o valor de a (inclinação da reta) e b (coeficiente linear), então podemos medir novos valores de E e encontrar os valores de [F-].

Considerando um outro exemplo, suponha que a absorbância de uma solução ( = Abs ) seja relacionada com a concentração de um complexo ( = [C] )pela equação:

Abs = 12114 [C] – 0,0026

Se uma amostra desconhecida indicar Abs = 0,255, qual será o valor da concentração?

Resp.:
Abs = 12114 [C] – 0,0026
0,255 = 12114 [C] – 0,0026
( 0,255 – (-0,0026) ) / 12114 = [C]
[C] = 2,13.10-5

Adição de padrão

Na adição de padrão são adicionadas pequenas quantidades do analito à amostra desconhecida, e através do aumento da resposta verificada podemos deduzir a quantidade inicial de analito na amostra. Para que este método possa ser empregado é necessário que a resposta seja linear.
A utilização deste método é especialmente recomendada quando a composição da amostra é complexa ou desconhecida e afeta o sinal analítico. A MATRIZ é tudo na amostra desconhecida além do analito. Um efeito de matriz é uma variação no sinal analítico causada por qualquer coisa na amostra além do analito (a matriz pode conter espécies que você desconhece, de modo que não poderá incluir na preparação dos brancos ou das soluções-padrão para construir uma curva de calibração, por exemplo).
Quando adicionamos um pequeno volume de padrão concentrado a uma amostra desconhecida não mudamos muito a concentração da matriz. A suposição na adição de padrão é que a matriz possui o mesmo efeito no analito adicionado que o analito possui na amostra desconhecida original.

Vamos considerar a análise por espectroscopia UV-Vis de uma solução de um fármaco F. Uma amostra com uma concentração desconhecida, [F] i , dá uma leitura de absorbância Abs Fi. A seguir é adicionada uma concentração conhecida de um padrão, [S] a uma alíquota de uma amostra e a absorbância medida é Abs S + F . A adição do padrão muda a concentração original do analito. Se chamamos a concentração diluída do analito de [F] f, onde o “f” quer dizer “final” e a concentração do padrão na solução final como [S] f temos a equação da adição-padrão:

Veja um exemplo: Uma solução contendo salicilato dá absorbância de 0,322 num determinado experimento. Adicionando 5,00 mL de uma solução 0,35 M de salicilato de sódio a 95,00 mL da solução original leva a absorbância para 0,774. Qual a concentração de salicilato na amostra original?

Para fazer um experimento com adição de padrão um bom procedimento é o seguinte:

  1. volumes iguais de uma solução conhecida são pipetados em uma série de balões volumétricos;
  2. volumes crescentes de uma solução-padrão são adicionados a cada um dos balões (no primeiro balão não se adiciona esta solução);
  3. cada balão é completado até a marca de calibração, diluindo então todas as soluções;
  4. analisar cada solução e construir um gráfico de concentração de analito adicionada, [S], versus sinal analítico.

Observe que cada balão tem a mesma concentração da amostra desconhecida e concentrações diferentes de padrão (atenção: o padrão é a mesma substância que está na amostra desconhecida).
No gráfico, o eixo X contém os valores de concentração do padrão adicionado depois de ter sido misturado com a amostra. O ponto onde a linha extrapolada do gráfico cruza o eixo X é a concentração da amostra após ela ter sido diluída ao volume final. Veja um gráfico deste tipo e um exemplo numérico:

Ex.: Numa determinação da quantidade de cádmio em amostras de efluentes industriais foi usado um eletrodo íon seletivo. Foi preparada uma solução-padrão de cádmio 0,02 M. Em cinco balões volumétricos de 50 mL foram colocados 5 mL da amostra e em seguida foram adicionados zero, 5, 10, 15 ou 20 mL do padrão (uma adição em cada balão), diluindo-se até o volume final. As leituras de potencial indicaram os seguintes valores: 30mV, 42mV, 53mV, 67mV e 78mV, respectivamente, para cada um dos balões. Qual a concentração de cádmio na amostra original?

Resp.: Observe que as concentrações do padrão em cada balão são as seguintes:

# Balão

Potencial medido (mV) (Y)

[padrão] (M) (X)

1

30

zero

2

42

0,002

3

53

0,004

4

67

0,006

5

78

0,008

Obs.: no balão 2 a diluição foi de 5mL de sol. 0,02 ppm para 50mL (portanto 10 vezes); no balão 3 a diluição foi de 10 mL de sol. 0,02M para 50 mL (portanto 5 vezes) e assim por diante.

Calculando a equação da reta por mínimos quadrados teremos que:

E = 0,0002 [padrão] – 0,0049


Fazemos a resposta analítica ser zero e encontramos então a concentração da amostra original (veja, no gráfico, que encontramos a concentração da amostra quando os valores de Y são zero). Assim,

0 = 0,002 [Cd] – 0,0049
[Cd] = 0,0049 / 0,002
[Cd] = 2,45 ppm

Como a amostra foi diluída de 5mL para 50mL, precisamos considerar esta diluição de dez vezes, encontrando finalmente
[Cd] = 2,45 x 10 = 24,5 ppm

Determinação simultânea em espectroscopia UV-Vis

Considere o seguinte problema:

Dados espectroscópicos de três indicadores – azul de timol, TB, azul de semitimol, STB e azul de metil timol, MTB - estão apresentados na tabela abaixo. Uma solução contendo os três indicadores, quando analisada em uma cubeta de 1 cm de caminho óptico, teve absorbância de 0,808 em 455nm, 0,520 em 485nm e 0,234 em 545nm. Qual a concentração de cada indicador nesta solução?

 

 

e (M-1 cm-1)  

l (nm)

TB

STB

MTB

455

4800

11100

18900

485

7350

11200

11800

545

36400

13900

4450

esp.: Como esperamos que a lei de Beer seja seguida em todos os casos, podemos escrever um sistema de equações lineares usando a expressão

   
     
   

Resolvendo o sistema pelo método matricial:


Determinante da matriz de coeficientes:

D = (4800 x 11200 x 4450) + (7350 x 13900 x 18900) + (36400 x 11800 x 11100) – (18900 x 11200 x 36400) – (11100 x 7350 x 4450) – (4800 x 13900 x 11800) = -1,9177.1012

Para calcular os valores substituímos o vetor solução na primeira coluna da matriz de coeficientes para encontrar a concentração de TB; substituindo na segunda teremos o valor de STB e fazendo o mesmo na terceira temos a resposta de MTB. O procedimento é:

Obs.: os valores de concentração estão em molar
Verifique os resultados, substituindo agora os valores de concentração no sistema original e comparando os valores de absorbância calculados e os medidos experimentalmente.